植物病害生防細菌的篩選策略綜述隨著農業種植結構的調整，瓜類和蔬菜保護地的重茬種植現象十分普遍，導致多種病害加劇發生，植物病害檢測儀進行病害檢測統計，發現以瓜類枯萎病、辣椒疫病等土傳病害尤為嚴重。由于此類病原菌存活于土壤之中，一般化學農藥難以奏效，生產中頻繁使用高毒農藥防治，從而加重了土壤農藥的殘留。另外，由于長期的化學防治，目前病原菌對現有殺菌劑的抗藥性問題十分嚴重，對當前農業的發展構成了嚴重的威脅。因此，出于環境保護和食品安全的需求，亟待開發新的、環境友好的微生物農藥。

　　生物農藥源于自然，環境相容性好，且具防效高、作用譜廣、對人畜低毒等特點，在病蟲害綜合治理中，是一類理想的可替代或部分替代化學農藥的植保產品。大力發展生物農藥及其相關產業符合當前我國農業和環境可持續發展的要求，有利于促進我國農業科技體制改革和農業產業結構的轉型，從發展方向上屬于優先支持和鼓勵發展的領域。而微生物農藥因其資源豐富、可再生性強，易于規模化工業生產，在生物農藥中占有重要地位，代表著植物保護的方向，未來有望得到迅速發展，在環境保護和農業的可持續發展中發揮重要作用。生防微生物是微生物農藥生產的源頭，一方面既可利用其活體直接用作農藥，又可分離提取其活性代謝產物加工成一定的農藥劑型;另一方面，農藥的合成經過幾十年的結構篩選已幾乎遍及可想象的化學類型，化學農藥的開發難度越來越大，成本越來越高，而微生物在進化過程中經受環境壓力的多樣性和復雜性導致了其代謝產物的多樣性，為新穎獨特的化學結構的發現和新農藥的創制提供了更多的機率，因而生防微生物資源的發掘利用也是開發創制新農藥的重要途徑。

　　1生防菌的主要類群：植物病害生防微生物的主要類群包括真菌、細菌和放線菌。生防真菌研究較多的有木霉、粘帚霉、擬青霉等。已知的木霉9個主要種中有5個種具有生防潛力，至少對18個屬29種植物病原真菌有拮抗作用，當前生產上利用多的是哈茨木霉，國外已有商品化的制劑問世，如美國的哈茨木霉T22和以色列的哈茨木霉。粘帚霉是習居于土壤的重寄生菌，對核盤菌、立枯絲核菌等植物土傳病原真菌及線蟲有很強的重寄生作用，且能產生次代謝產物，從粘帚霉中分離獲得的抗菌物質已達50多個;近年來對其分離、鑒定、生物學特性、生防作用及其抗病機制的研究均有報道。擬青霉中著名的是淡紫擬青霉，為植物寄生線蟲的重要天敵，能夠有效防治根結線蟲和胞囊線蟲。生防細菌以繁殖速度快、易培養和在植株體內定殖轉移等特點成為重要的生防資源。已有研究表明，至少有13個屬的細菌具有生防潛力，其中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和土壤桿菌屬是目前研究的熱點。芽孢桿菌為土壤和植物微生態優勢種群，抗逆性強，是一類理想的生防菌，應用較多的是枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，國外已有商品化產品GB03、MBI600、QST713和FZB24等，可防治鐮刀菌等引起的根部病害;國內已商品化的制劑有麥豐寧、亞寶、百抗、紋曲寧等，中國農大開發的“增產菌”已在水稻、小麥等50多種植物上應用。假單胞菌是典型的根際細菌，其生防機制主要為營養和病菌侵染位點的競爭，兼有拮抗作用，其中熒光假單胞菌、洋蔥假單胞菌、惡臭假單胞菌中的菌系用于馬鈴薯、胡蘿卜和小麥，增產效果分別達5%~33%，6%~14.4%和16.5%~28.1%;著名的植物根際促生細菌(PGPR)亦主要為熒光假單胞菌。放射土壤桿菌主要用于防治根癌病，澳大利亞分離的菌株可完全控制核果類果樹和玫瑰根癌病的發生，已在澳大利亞商品化;A.tumefaciens和A.vitis的無致病性菌株D286、HLB-2和F2/5、E26對不同的根癌病也有很好的抑制作用;中國農大開發的放射土壤桿菌可濕性粉劑對核果類果樹根癌病防效達100%，已于2000年獲得注冊登記。放線菌是早發現的具有生防效果的微生物，其生防作用主要靠產生生物活性物質，在已發現的微生物活性產物中，約有2/3由放線菌產生，而鏈霉菌是重要的抗生素產生菌，生產上應用的農用抗生素約80%的活性成分均源于鏈霉菌，目前國內對生防放線菌的利用也主要集中于抗生素，如井岡霉素全國推廣面積年約達870萬hm2，其它如農抗120、多抗霉素、武夷菌素、中生菌素、寧南霉素等也已正式登記或臨時登記;放線菌的活體制劑已廣泛應用的是Mycostop，主要用于防治腐霉菌、鐮刀菌、疫霉菌和絲核菌等引起的土傳病害;我國分離獲得的細黃鏈霉菌制成的“5406”抗生菌也有一定的推廣面積。

　　2生防菌的篩選策略：長期以來，微生物資源的開發利用以醫藥開發為主導，特別是對放線菌類所產生的醫用抗生素的研究較多。在分離和篩選方法上，20世紀60年代中期以前，由于有豐富的微生物資源可供研究，不需復雜的方法便能隨機篩選到目的菌株。隨著科學技術的不斷進步，開發新藥物的難度也大大增加，因此，許多新篩選方法應運而生。報道較多的新藥篩選方法有靶標定向篩選和高通量篩選，前者是將某種藥物或其特異基團作為靶標進行定向檢測而建立各種不同的篩選程序，大大提高了新藥篩選效率;后者則由化合物庫、靶體選擇、靶體和化合物反應的測試方法、靶體作用物的高通量篩選和數據的信息處理系統組成篩選平臺，針對各種藥物靶體從種類繁多的化合物中篩選佳的先導化合物，進而開發新藥物。此外，快速分子篩選方法也已得到應用，美國Cyanamid公司運用獨特的分子篩選技術從世界各地采集的海洋微生物中尋找具有抗菌、抗病毒、抗癌等苗頭的藥物;我國徐平等依據放線菌基因組中大環聚酮類化合物生物合成途徑所用的I型PKS合成酶基因的存在與否標定可能的大環聚酮類天然產物產生菌，建立了快速、簡便、的大環聚酮類化合物產生菌基因篩選體系。分子生物學和分子藥理學的研究闡明了許多生物大分子如酶、受體和離子通道等與病害之間的關系，這些生物大分子正逐步取代傳統的藥物篩選方法，發展成為藥物初篩的主要靶標。　　在微生物棲息環境的選擇上，許多實驗室已轉向端環境微生物資源研究，包括嗜堿、嗜鹽、嗜酸、端高低溫、高壓、輻射等特殊環境微生物以及植物內生菌，近年海洋微生物資源也成了新的研究熱點。在藥源微生物的類群上，特別是在放線菌中，鏈霉菌以外的稀有放線菌被認為是新藥的重要來源。

　　據估計，每克土壤中微生物數量高達4000種，而采用現有技術能夠培養的僅為微生物總數的1%~10%，多達90%~99%的不可培養微生物正在成為開拓新資源的目標;基于此，Handesman等提出了一個全新的理念———“宏基因組克隆”，直接提取環境中所有微生物的基因組DNA，克隆到合適的載體，構建宏基因組文庫，再運用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得酶、抗生素等生物活性物質及相關基因。該研究策略克服了多數土壤微生物無法分離培養的難題，增加了獲得新生物活性物質的機會，已得到成功的應用。迄今人類所認知的真菌約7萬多種，細菌5000多種，放線菌3000多種，而實際利用的可能還不到0.1%，再加上90%~99%未知的種類，可見對自然界微生物資源的研究和開發仍有十分廣闊的空間。

　　3目前研究中存在的問題與對策：植物病害生防微生物菌種的評價和篩選傳統上注重其生物活性的考察，一般以作物病害沒有發生、病害減少或不能發展的土壤為主要來源，經室內離體生測、溫室植株接種和田間防效實驗，終篩選出可在生產上應用的生防菌。

　　此過程歷時長，工作量大，且室內篩選和田間應用的效果往往不一致，造成菌株的漏選。更重要的是，如上所述，經過多年的活性篩選，傳統的方法在常規的生態環境中已很難獲得具有新活性或產生新物質的菌株，所以往往是已知活性菌株的重復性試驗和小范圍內的應用，缺少創新性的突破，也就很難形成規模化生產。近年對一些與抗病作用機制有關的基因或酶類等生物大分子的檢測技術也逐漸應用到生防菌的篩選和評價研究中，如通過PCR技術檢測鐮刀霉素合成基因fusA、β-1,3-葡聚糖酶基因、表面活性肽合成基因、幾丁質酶基因，通過生化的方法檢測木霉生防菌株中幾丁質酶的活力等。但總的看，生防微生物資源的研究較醫藥微生物資源相對落后，因此，借鑒醫藥源微生物資源開發的新技術，優選生防微生物發掘的生態環境，擴大篩選范圍和信息的獲取量，加強生防微生物新穎性的科學評價，在此基礎上建立新的菌株篩選體系，以增加新菌株發現的機率，是微生物新農藥創制中亟待加強的重要基礎科學問題。

　　我國微生物資源豐富，發展微生物農藥的條件得天獨厚。而如何從豐富的微生物資源中分離篩選創新性菌株是成功創制微生物新農藥、開發自主知識產權的新產品的先決條件。目前我國生物農藥占市場份額僅為1.7%左右，遠低于世界平均水平，與發達相比尚有較大差距，存在的突出問題主要是：仿制國外產品多，原創性拳頭產品少。究其原因，對生防微生物資源的創新性研究不夠，雖然篩選獲得了許多具有抗病活性的目標生物，但缺乏能夠用于生產新農藥的菌株是關鍵性瓶頸之一。因此，在未來研究中，研究者需利用現代生物技術與傳統的生物學方法有機結合，搭建生防微生物資源創新研究平臺，發掘新的生防微生物資源，力爭在新的關鍵生防因子的發現和利用方面有所突破。